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一文揭开CRISPR/Cas技术的神秘面纱

  • 日期: 2017-02-23 15:24:49
  • 来源:爱尔眼科研究所
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概念:
    CRISPR-Cas系统是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导的Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术,可用来对抗入侵的病毒及外源性DNA。其中CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),首次在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因位点附近发现,后统一称为成簇规律间隔短回文重复序列,是在大多数细菌、古细菌中广泛存在的一类独特的DNA规律性重复序列。由高度保守的重复序列和间隔序列(protospacer)组成,前者为CRISPR位点,后者识别靶基因。Cas(CRISPR-associated)protein,顾名思义,为CRISPR相关蛋白,其基因为位于CRISPR区域临近处的蛋白质编码基因,而且相对保守。Cas基因可与CRISPR转录的crRNA结合并形成核糖核蛋白复合物,在原核生物中发挥获得性免疫功能,使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力(图1)。 

   
图1. CRISPR/Cas 系统组成结构                            
  
 
    CRISPR/Cas系统分为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ三种类型。其中TypeⅡ系统是目前基因编辑的常用系统,其主要是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白),参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或者外源质粒。
 
作用原理:
    CRISPR/Cas9系统分为三个阶段:识别、表达和干扰(图2)。
    识别阶段:对外来DNA进行采集。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时,Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA,并识别出PAM区域,然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。随后,Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来,并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。然后,DNA会进行修复,将打开的双链缺口闭合。这样一来,一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。
    表达阶段:CRISPR RNA生物合成。CRISPR序列在前导序列的调控下,被转录为长的crRNA前体(Pre-CRISPR RNA,Pre-crRNA)及 tracrRNA,然后Pre-CRISPR RNA加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA,每一个成熟crRNA都包含与之前遇到的外源DNA(Spacer序列)对应的互补序列crRNA与tracrRNA通过碱基配对结合形成crRNA/tracrRNA复合物并改装为sgRNA。
    干扰阶段:对目标DNA序列进行靶向干扰。Cas9结合sgRNA,通过sgRNA上的靶序列来识别目标基因的靶序列并解开双螺旋剪切DNA分子造成DNA双链断裂以降解外来核酸分子。
 
CRISPR/Cas技术在临床上的应用
(1)体外编辑修复:


图3A. CRISPR/Cas体外编辑修复iPSCs后再将修复后的iPSCs分化为靶细胞植入体内    
(2)体内编辑修复:



图3b. 将设计好的CRISPR/Cas复合物直接植入体内修复体细胞              
CRISPR/Cas在眼部疾病中的应用
    CRISPR/Cas的靶向调控机制为研究和治疗人类疾病开辟了激动人心的道路。其作为一种简单明确的技术,在体内、体外均可进行基因编辑。基因工程对于治疗由基因突变引起的具有特定的空间和化学计量表达的遗传性疾病具有特别的吸引力,例如这些遗传性非综合征性眼部疾病。通过对基因组DNA的直接编辑,诱导DNA缺口或断裂和随后的修复,被纠正基因仍受控于正常的内源性表达控制元素。CRISPR/Cas技术可以避免潜在的基因异位表达和反常的基因转录,并且还可以很好的解决病毒载体容量限制的问题。加上眼部有利的解剖和免疫豁免特点,使眼部疾病的研究走在此项技术向临床应用转换的前列。可以预见的是CRISPR/Cas技术的临床应用建立在个性化的基因编辑方案上。    
    将基于CRISPR技术的治疗方法应用于临床的一个最重要的方面是有效且高效的将其转运入特定的组织或细胞。其中在体内基因转运最有效的方式是通过病毒载体。AAV介导的基因转录可持续平稳表达数月,而且基因整合常位于人基因组特定区域。视网膜下注射AAV的安全性和有效性已在多种动物模型和人类临床试验中得到证实。除了注射的副作用外,没有一项临床试验报道AAV的任何毒副作用。
遗传性眼病影响了全世界数百亿人民,对社会经济产生了重大负担。许多致盲的疾病是由遗传性的视网膜细胞变性造成的,在美国,遗传性视网膜疾病是工作年龄的成年人失明的首要病因。不幸的是,尽管已经识别很多遗传性视网膜变性的具体基因突变,但目前均无法治愈这些疾病。基因编辑技术的发展或许能为此类眼病的治疗提供一条康庄大路。